NAD+ et NADH : structure, chimie redox et biosynthèse

Le NAD+ — nicotinamide adénine dinucléotide — fait partie des rares molécules qui apparaissent dans pratiquement chaque chapitre d’un cours de biochimie. Il est présent dans toute cellule vivante, il est l’accepteur d’électrons de presque toutes les étapes oxydatives du catabolisme, et il est en même temps la matière première qu’une famille entière d’enzymes de signalisation découpe et rejette. Le comprendre correctement suppose de tenir ces deux rôles ensemble.

Cet article porte sur la molécule et sa chimie : comment le NAD est construit, ce qui lui arrive dans une réaction redox, ce qui le distingue du NADP, quelles enzymes l’utilisent et d’où une cellule le tire. Un autre article de ce site, l’aperçu de recherche sur le NAD+, traite du NAD+ en tant que composé de recherche et de la littérature sur les sirtuines et la biologie du vieillissement qui l’entoure. Rien ici ne décrit d’usage humain, de supplémentation, de posologie ni de résultats thérapeutiques.

Définition du NAD+ : ce qu’est la molécule en biologie

NAD signifie nicotinamide adénine dinucléotide. C’est une coenzyme — une petite molécule organique non protéique dont une enzyme a besoin pour réaliser sa réaction — d’une masse moléculaire d’environ 663 g/mol. Sa fonction biologique est double. D’abord, et c’est le plus connu, il est le transporteur universel d’électrons du catabolisme : la molécule qui collecte les électrons arrachés aux sucres, aux acides gras et aux acides aminés et les livre à la chaîne respiratoire. Ensuite, il est le donneur d’ADP-ribose d’un ensemble d’enzymes qui le dépensent au lieu de le recycler, ce qui oblige les cellules à le resynthétiser en continu. La notation NAD+ désigne précisément la forme oxydée et NADH la forme réduite ; « NAD » sans suffixe renvoie généralement à la molécule indépendamment de son état redox.

La structure du NAD : deux nucléotides et un pont pyrophosphate

Un nucléotide, c’est une base azotée plus un sucre plus un phosphate. Le NAD en compte deux, reliés queue à queue. Une moitié est le mononucléotide de nicotinamide (NMN) : un groupe nicotinamide fixé à un D-ribose portant un 5′-phosphate. L’autre moitié est l’adénosine monophosphate (AMP) : une base adénine fixée à son propre D-ribose, portant elle aussi un 5′-phosphate. Les deux 5′-phosphates sont reliés entre eux par une liaison phosphoanhydride, ce qui donne le pont pyrophosphate (diphosphate) qui tient la molécule ensemble. L’inventaire complet est donc : un cycle nicotinamide, un cycle adénine, deux riboses sous forme β-furanose et deux phosphates. Les deux bases sont fixées à leurs sucres par des liaisons β-N-glycosidiques — l’adénine par son N9, le nicotinamide par l’azote de son cycle pyridine.

Ce dernier détail explique pourquoi le cycle nicotinamide est la partie active de la molécule. Fixer l’azote du cycle au sucre en fait un azote quaternaire sans doublet libre, porteur d’une charge positive formelle. C’est le « + » de NAD+, et c’est ce qui rend le cycle pyridinium pauvre en électrons, donc bon accepteur. Tout ce qui se trouve de l’autre côté du pont pyrophosphate — l’adénine, le second ribose — ne participe pas du tout à la chimie. Cette partie fait office de poignée moléculaire : une queue volumineuse, caractéristique et chargée négativement que les enzymes saisissent, et grâce à laquelle une déshydrogénase distingue le NAD de toute autre petite molécule qui passe. Le motif classique de liaison de cette poignée est le repliement de Rossmann, une unité βαβ dotée d’une boucle riche en glycine que l’on retrouve dans des centaines de déshydrogénases par ailleurs sans parenté.

Le couple redox NAD+/NADH : le NAD+ est l’accepteur d’électrons

Oui, le NAD+ est un accepteur d’électrons, et le NAD+ est réduit en NADH. Le transfert est un événement chimique unique : le NAD+ accepte un ion hydrure, noté H−, c’est-à-dire un proton emportant avec lui deux électrons, et cet hydrure s’additionne sur le carbone 4 du cycle nicotinamide. Lorsqu’une déshydrogénase retire deux atomes d’hydrogène à son substrat, un seul voyage sous forme d’hydrure ; le second est libéré en solution sous forme de proton libre. D’où l’équation standard, substrat-H2 + NAD+ → substrat + NADH + H+, et d’où le fait que la forme réduite s’écrive NADH et non NADH2. La conséquence chimique est spectaculaire : le cycle pyridinium aromatique devient une 1,4-dihydropyridine non aromatique et la charge positive disparaît. Le potentiel standard de réduction du couple est d’environ −0,32 V, ce qui place le NADH à l’extrémité riche en électrons de l’échelle redox biologique et explique qu’il puisse réduire presque tout transporteur rencontré en aval. Les déshydrogénases sont de plus stéréospécifiques et livrent l’hydrure sur une face déterminée du C4, la distinction classique entre face A et face B.

C’est ici que surgit d’ordinaire la question « le NAD+ est-il un substrat ou un produit ? », et la réponse honnête est qu’il n’est ni l’un ni l’autre au sens habituel. C’est un cofacteur recyclé, parfois appelé cosubstrat : il s’écrit du côté des substrats dans une réaction et du côté des produits dans la suivante, parce qu’il alterne entre deux formes plutôt que d’être créé et détruit. La glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase transforme le NAD+ en NADH ; la lactate déshydrogénase et le complexe I ramènent le NADH à NAD+. À l’échelle d’une voie métabolique il n’y a pas de consommation nette, et un pool relativement petit — le NAD cellulaire total se situe typiquement dans la gamme de quelques centaines de micromolaires — soutient un flux considérable parce qu’il se renouvelle sans cesse. Ce qui complique le tableau, c’est qu’une seconde classe d’enzymes le consomme réellement, en clivant la molécule au lieu de la réduire : sur une échelle de temps plus longue, le NAD+ est donc bel et bien un substrat consommé qu’il faut remplacer.

Une conséquence pratique de la chimie du cycle mérite une mention à part, car elle sous-tend une bonne part de tous les dosages enzymatiques jamais réalisés. Le cycle 1,4-dihydropyridine du NADH absorbe l’ultraviolet vers 340 nm avec un coefficient d’extinction molaire d’environ 6220 M−1 cm−1, alors que le cycle aromatique du NAD+ n’y absorbe pas du tout. Les deux formes absorbent à 260 nm en raison de l’adénine, de sorte que 340 nm renseigne spécifiquement sur la forme réduite. Toute réaction produisant ou consommant du NADH peut donc être suivie en temps réel comme une absorbance croissante ou décroissante à 340 nm, et les réactions de déshydrogénases sont couramment couplées à d’autres enzymes uniquement pour engendrer ce signal. Le NADH est en outre fluorescent, avec une excitation proche de 340 nm et une émission proche de 460 nm, ce que le NAD+ n’est pas, ce qui transpose le même procédé à la microscopie.

NAD et NADP : un phosphate, deux métiers différents

NADP signifie nicotinamide adénine dinucléotide phosphate. Structurellement, c’est du NAD avec un ajout : un groupe phosphate estérifié sur le 2′-hydroxyle du ribose de la moitié adénosine, installé par l’enzyme NAD kinase. Ce phosphate se situe loin du carbone 4 et ne change pas la chimie redox : le NADP+ accepte un hydrure exactement de la même façon et devient NADPH. Ce qu’il change, c’est la reconnaissance. Dans de nombreuses enzymes à repliement de Rossmann, un résidu aspartate établit des liaisons hydrogène avec les 2′- et 3′-hydroxyles libres du NAD ; les enzymes préférant le NADP remplacent ce résidu acide par un résidu basique qui accueille la charge négative supplémentaire. Un seul phosphate répartit ainsi les deux coenzymes entre deux populations enzymatiques presque disjointes, et la cellule exploite cette séparation en les maintenant dans des états redox opposés. Le pool de NAD est tenu fortement oxydé, si bien que le NAD+ dépasse largement le NADH et qu’un accepteur reste toujours disponible pour que le catabolisme continue. Le pool de NADP est tenu fortement réduit, si bien que le NADPH dépasse largement le NADP+ et qu’un donneur reste toujours disponible pour la chimie réductrice.

Enzymes dépendantes du NAD : déshydrogénases et consommateurs de NAD+

Les enzymes dépendantes du NAD classiques sont les déshydrogénases, et elles répondent aussi à la question de savoir où le NADH est fabriqué. Dans la glycolyse, la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase réduit le NAD+ en NADH dans le cytosol. Dans la matrice mitochondriale, le complexe de la pyruvate déshydrogénase recommence, et le cycle de l’acide citrique le fait trois fois de plus par tour, via l’isocitrate déshydrogénase, l’alpha-cétoglutarate déshydrogénase et la malate déshydrogénase. La bêta-oxydation des acides gras apporte un NADH de plus par cycle via la 3-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase, et le catabolisme des acides aminés en ajoute encore par des enzymes comme la glutamate déshydrogénase. Les électrons repartent ensuite : le NADH est réoxydé en NAD+ par le complexe I de la chaîne de transport des électrons, la NADH:ubiquinone oxydoréductase, qui les transmet à l’ubiquinone et utilise l’énergie libérée pour pomper des protons. Comme la membrane mitochondriale interne ne laisse pas passer le NADH, le NADH cytosolique atteint la chaîne indirectement par les navettes malate-aspartate et glycérol-3-phosphate. Quand la chaîne ne suit plus, ce sont les enzymes fermentaires qui assurent la régénération : la lactate déshydrogénase réoxyde le NADH cytosolique afin que la glycolyse dispose de NAD+ et puisse continuer.

Le second groupe fonctionne sur des principes tout autres. Les sirtuines, les PARP et les NAD+ glycohydrolases ne réduisent pas le NAD+ ; elles rompent la liaison N-glycosidique entre le nicotinamide et son ribose, transfèrent la portion ADP-ribose là où elle est utile, et libèrent du nicotinamide libre. Les sirtuines dépensent un NAD+ par désacylation de protéine, produisant du nicotinamide et du 2′-O-acyl-ADP-ribose. Les PARP transfèrent des unités d’ADP-ribose sur des protéines accepteuses, l’activation de PARP1 par des cassures de l’ADN étant le cas le plus étudié et capable d’abaisser sensiblement le pool de NAD+ dans les modèles cellulaires. CD38, CD157 et l’enzyme à domaine TIR SARM1 hydrolysent ou cyclisent le NAD+ en ADP-ribose et ADP-ribose cyclique. Comme toutes détruisent la molécule, le renouvellement du NAD+ dans une cellule est rapide — décrit à une échelle d’heures plutôt que de jours dans plusieurs types cellulaires — et les voies de biosynthèse qui suivent ne sont pas une formalité mais une exigence continue.

D’où vient le NAD+ ? Trois voies vers la même molécule

Le NAD+ provient de trois voies de biosynthèse convergentes, qui toutes se terminent par l’assemblage du dinucléotide à partir d’un intermédiaire mononucléotidique. Une seule d’entre elles construit le cycle pyridine de zéro ; les deux autres partent d’un cycle ingéré, absorbé ou récupéré. Le point de convergence est la famille enzymatique NMNAT (nicotinamide mononucléotide adényltransférase), qui rattache la moitié AMP à la moitié nicotinamide en utilisant l’ATP et qui existe en trois isoformes aux adresses distinctes : NMNAT1 dans le noyau, NMNAT2 dans le cytosol, NMNAT3 dans les mitochondries. Cette compartimentation compte, car le NAD+ est une grosse molécule chargée qui ne traverse pas librement les membranes : chaque compartiment entretient donc son propre pool.

• La synthèse de novo à partir du tryptophane, par la voie de la kynurénine. Le tryptophane est ouvert par IDO ou TDO en N-formylkynurénine puis transformé via la kynurénine et le 3-hydroxyanthranilate en acide quinolinique, que la quinolinate phosphoribosyltransférase convertit en mononucléotide d’acide nicotinique. C’est la seule voie qui fabrique le cycle lui-même ; elle opère surtout dans le foie et le rein et elle est peu efficace : l’équivalence classique des manuels est d’environ 60 mg de tryptophane pour 1 mg de niacine.
• La voie de Preiss-Handler, à partir de l’acide nicotinique. La nicotinate phosphoribosyltransférase condense l’acide nicotinique avec le PRPP pour donner le mononucléotide d’acide nicotinique ; la NMNAT l’adénylyle en dinucléotide d’acide nicotinique et d’adénine, et la NAD synthétase dépendante de la glutamine l’amide en NAD+.
• La voie de récupération, à partir du nicotinamide. La nicotinamide phosphoribosyltransférase (NAMPT) condense le nicotinamide avec le PRPP pour donner le mononucléotide de nicotinamide, et la NMNAT achève la molécule. La NAMPT est l’étape limitante, et son inhibition en culture cellulaire effondre les niveaux de NAD+ en quelques heures.
• Les points d’entrée du riboside et du mononucléotide. Le riboside de nicotinamide est phosphorylé par les kinases du riboside de nicotinamide NRK1 et NRK2 en mononucléotide de nicotinamide, rejoignant la voie de récupération une étape en aval de la NAMPT. Le NMN extracellulaire est généralement décrit comme déphosphorylé par l’ectoenzyme CD73 en riboside avant absorption ; l’existence d’un transporteur direct du NMN reste une question ouverte dans la littérature.

Dans la plupart des cellules de mammifère, la voie de récupération domine, et la raison en est structurelle et non fortuite. Chaque réaction de sirtuine, de PARP ou de CD38 libère une molécule de nicotinamide : la cellule produit donc en permanence exactement le substrat dont la NAMPT a besoin. La récupération referme cette boucle, du nicotinamide issu des enzymes consommatrices vers le NMN puis vers le NAD+. La synthèse de novo à partir du tryptophane fournit une part relativement faible en dehors du foie, et la voie de Preiss-Handler dépend de l’arrivée d’acide nicotinique par l’alimentation ou le microbiote intestinal. Une cellule privée de capacité de récupération ne peut compenser assez vite par les deux autres voies, et c’est pourquoi l’inhibition de la NAMPT est un outil expérimental si largement employé pour épuiser le NAD+ in vitro.

Ce que les données n’établissent pas

Tout ce qui précède relève d’une biochimie établie, bâtie sur des décennies de travaux d’enzymologie et de biologie structurale, et il vaut la peine de dire explicitement que les allégations commerciales portant sur les produits au NAD+ n’en découlent pas. Qu’une molécule soit indispensable au métabolisme ne dit rien de ce qui se produit si l’on cherche à l’augmenter. La littérature n’établit pas :

• De résultats anti-âge, énergétiques ou de longévité chez l’humain. Les rapports faisant état d’une baisse du NAD+ tissulaire avec l’âge proviennent en grande partie de modèles animaux et sont techniquement difficiles à quantifier, le NAD+ étant labile et se dégradant lors de l’extraction ; ce ne sont pas des preuves d’un bénéfice humain lié à son augmentation.
• Qu’élever un taux mesuré de métabolites du NAD+ produise le moindre résultat fonctionnel. Les essais portant sur des molécules précurseurs ont généralement retenu des marqueurs biochimiques comme critères d’évaluation, et non des critères cliniques.
• Que du NAD+ apporté depuis l’extérieur de la cellule atteigne intact le pool intracellulaire. Le NAD+ est volumineux et chargé, ne traverse pas librement la membrane plasmique, et le NAD+ extracellulaire est en grande partie dégradé par des ectoenzymes avant toute absorption.
• La posologie, les voies d’administration ou la sécurité chez l’humain : la biochimie décrite ici n’aborde aucun de ces points.
• Que les résultats sur les sirtuines et la biologie du vieillissement chez la levure, les vers, les mouches et les souris soient transposables aux personnes. Cela reste inconnu.

Les références ci-dessous renvoient à la littérature primaire sur la biosynthèse du NAD, l’enzymologie redox et les familles d’enzymes consommatrices de NAD+, et la page produit détaille la documentation analytique disponible pour le matériel de recherche.