NAD+ и NADH: строение, редокс-химия и биосинтез

NAD+ — никотинамидадениндинуклеотид — одна из немногих молекул, которая встречается практически в каждой главе курса биохимии. Он присутствует в каждой живой клетке, служит акцептором электронов почти во всех окислительных стадиях катаболизма и одновременно является сырьём, которое целое семейство сигнальных ферментов расщепляет и выбрасывает. Понять его как следует — значит удерживать обе эти роли одновременно.

Эта статья — о самой молекуле и её химии: как устроен NAD, что с ним происходит в окислительно-восстановительной реакции, чем он отличается от NADP, какие ферменты его используют и откуда клетка его получает. Отдельная статья на этом сайте, научный обзор NAD+, посвящена NAD+ как исследовательскому соединению и литературе о сиртуинах и биологии старения. Здесь не описывается применение у человека, приём добавок, дозировки или терапевтические результаты.

Определение NAD+: что это за молекула в биологии

NAD расшифровывается как никотинамидадениндинуклеотид. Это кофермент — небольшая небелковая органическая молекула, без которой фермент не может провести свою реакцию, — с молекулярной массой около 663 г/моль. Его биологическая функция двойная. Во-первых, и это известно лучше всего, он служит универсальным переносчиком электронов в катаболизме: собирает электроны, снятые с сахаров, жирных кислот и аминокислот, и доставляет их в дыхательную цепь. Во-вторых, он является донором АДФ-рибозы для группы ферментов, которые его не перерабатывают, а расходуют, — поэтому клетке приходится непрерывно синтезировать его заново. Обозначение NAD+ относится именно к окисленной форме, NADH — к восстановленной; «NAD» без индекса обычно означает молекулу безотносительно её редокс-состояния.

Строение NAD: два нуклеотида и пирофосфатный мостик

Нуклеотид — это азотистое основание плюс сахар плюс фосфат. NAD состоит из двух нуклеотидов, соединённых «хвост к хвосту». Одна половина — никотинамидмононуклеотид (NMN): никотинамидная группа при D-рибозе с 5′-фосфатом. Вторая половина — аденозинмонофосфат (AMP): аденин при собственной D-рибозе, также с 5′-фосфатом. Два 5′-фосфата связаны между собой фосфоангидридной связью, образуя пирофосфатный (дифосфатный) мостик, который держит молекулу вместе. Итоговая опись: одно никотинамидное кольцо, одно адениновое, две рибозы в β-фуранозной форме и два фосфата. Оба основания присоединены к своим сахарам β-N-гликозидными связями — аденин через N9, никотинамид через азот пиридинового кольца.

Именно последняя деталь объясняет, почему никотинамидное кольцо — рабочая часть молекулы. Присоединение азота кольца к сахару делает его четвертичным, без свободной неподелённой пары, и он несёт формальный положительный заряд. Это и есть «+» в NAD+, и именно он делает пиридиниевое кольцо электронодефицитным, а значит, хорошим акцептором электронов. Всё, что находится по другую сторону пирофосфатного мостика — аденин, вторая рибоза, — в химии реакции не участвует вовсе. Эта часть работает как молекулярная рукоятка: крупный, характерный, отрицательно заряженный «хвост», за который ферменты держатся и по которому дегидрогеназа отличает NAD от любой другой малой молекулы поблизости. Классический мотив связывания этой рукоятки — россмановская укладка, βαβ-структура с богатой глицином петлёй, встречающаяся у сотен во всём остальном неродственных дегидрогеназ.

Пара NAD+/NADH: NAD+ как акцептор электронов

Да, NAD+ — акцептор электронов, и NAD+ восстанавливается до NADH. Перенос представляет собой одно химическое событие: NAD+ принимает гидрид-ион, H−, то есть протон, несущий с собой два электрона, и этот гидрид присоединяется к четвёртому атому углерода никотинамидного кольца. Когда дегидрогеназа снимает с субстрата два атома водорода, только один из них уходит в виде гидрида; второй высвобождается в раствор как свободный протон. Отсюда стандартное уравнение: субстрат-H2 + NAD+ → субстрат + NADH + H+, и отсюда же то, что восстановленная форма записывается как NADH, а не NADH2. Химическое следствие радикально: ароматическое пиридиниевое кольцо превращается в неароматический 1,4-дигидропиридин, а положительный заряд исчезает. Стандартный восстановительный потенциал пары составляет около −0,32 В, что помещает NADH у богатого электронами края биологической редокс-шкалы и объясняет, почему он способен восстановить почти любой встречающийся ему далее переносчик. Дегидрогеназы к тому же стереоспецифичны и доставляют гидрид к строго определённой стороне C4 — классическое разделение на A- и B-тип.

Именно здесь обычно и возникает вопрос «NAD+ — это субстрат или продукт?», и честный ответ таков: в обычном смысле ни то ни другое. Это перерабатываемый кофактор, который иногда называют косубстратом: он записывается со стороны субстратов в одной реакции и со стороны продуктов в следующей, потому что он переходит между двумя формами, а не создаётся и уничтожается. Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа превращает NAD+ в NADH; лактатдегидрогеназа и комплекс I возвращают NADH обратно в NAD+. В масштабе всего пути чистого расхода нет, и сравнительно небольшой пул — суммарное содержание NAD в клетке обычно измеряется сотнями микромолей на литр — обеспечивает огромный поток за счёт многократного оборота. Картину усложняет то, что второй класс ферментов действительно его расходует, расщепляя молекулу, а не восстанавливая её, — так что на более длительном отрезке времени NAD+ и вправду является расходуемым субстратом, который нужно восполнять.

Одно практическое следствие химии кольца заслуживает отдельного упоминания, потому что на нём построена изрядная часть всех когда-либо поставленных ферментных проб. Кольцо 1,4-дигидропиридина в NADH поглощает ультрафиолет около 340 нм с молярным коэффициентом экстинкции примерно 6220 M−1 см−1, тогда как ароматическое кольцо NAD+ там не поглощает вовсе. Обе формы поглощают при 260 нм за счёт аденина, поэтому именно 340 нм сообщает о восстановленной форме. Любую реакцию, образующую или потребляющую NADH, можно поэтому наблюдать в реальном времени как рост или падение поглощения при 340 нм, а реакции дегидрогеназ регулярно сопрягают с другими ферментами исключительно ради такого сигнала. NADH к тому же флуоресцирует — возбуждение около 340 нм, испускание около 460 нм, — а NAD+ нет, что переносит тот же приём в область микроскопии.

NAD и NADP: один фосфат, две разные задачи

NADP расшифровывается как никотинамидадениндинуклеотидфосфат. Структурно это тот же NAD с одним добавлением: фосфатной группой, этерифицированной по 2′-гидроксилу рибозы аденозиновой половины и устанавливаемой ферментом NAD-киназой. Этот фосфат расположен далеко от четвёртого углерода и не меняет редокс-химию: NADP+ принимает гидрид точно так же и становится NADPH. Что он меняет, так это узнавание. Во многих ферментах с россмановской укладкой остаток аспартата образует водородные связи со свободными 2′- и 3′-гидроксилами NAD; в ферментах, предпочитающих NADP, этот кислый остаток заменён основным, который принимает дополнительный отрицательный заряд. Один фосфат таким образом разводит два кофермента по двум почти непересекающимся популяциям ферментов, и клетка использует это разделение, удерживая их в противоположных редокс-состояниях. Пул NAD держится сильно окисленным, так что NAD+ намного превосходит NADH и акцептор для продолжения катаболизма всегда доступен. Пул NADP держится сильно восстановленным, так что NADPH намного превосходит NADP+ и донор для восстановительной химии всегда под рукой.

NAD-зависимые ферменты: дегидрогеназы и потребители NAD+

Классические NAD-зависимые ферменты — это дегидрогеназы, и они же дают ответ на вопрос, где образуется NADH. В гликолизе глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа восстанавливает NAD+ до NADH в цитозоле. В митохондриальном матриксе то же самое делает пируватдегидрогеназный комплекс, а цикл трикарбоновых кислот повторяет это ещё трижды за оборот — через изоцитратдегидрогеназу, α-кетоглутаратдегидрогеназу и малатдегидрогеназу. Бета-окисление жирных кислот добавляет ещё по одному NADH за цикл через 3-гидроксиацил-КoA-дегидрогеназу, а катаболизм аминокислот — через такие ферменты, как глутаматдегидрогеназа. Затем электроны уходят: NADH окисляется обратно до NAD+ комплексом I цепи переноса электронов, NADH:убихинон-оксидоредуктазой, которая передаёт их убихинону и использует освободившуюся энергию для перекачки протонов. Поскольку внутренняя мембрана митохондрий не пропускает NADH, цитозольный NADH достигает цепи опосредованно — через малат-аспартатный и глицерол-3-фосфатный челноки. Когда цепь не справляется, регенерацию берут на себя ферменты брожения: лактатдегидрогеназа заново окисляет цитозольный NADH, чтобы у гликолиза был доступный NAD+ и он мог продолжаться.

Вторая группа работает на совершенно иных принципах. Сиртуины, PARP и NAD-гликогидролазы не восстанавливают NAD+; они разрывают N-гликозидную связь между никотинамидом и его рибозой, переносят АДФ-рибозную часть туда, где она нужна, и высвобождают свободный никотинамид. Сиртуины тратят один NAD+ на каждое деацилирование белка, образуя никотинамид и 2′-O-ацил-АДФ-рибозу. PARP переносят звенья АДФ-рибозы на белки-акцепторы, причём активация PARP1 разрывами ДНК — наиболее изученный случай, способный существенно истощить пул NAD+ в клеточных моделях. CD38, CD157 и фермент с TIR-доменом SARM1 гидролизуют или циклизуют NAD+ до АДФ-рибозы и циклической АДФ-рибозы. Поскольку все они разрушают молекулу, оборот NAD+ в клетке быстрый — в ряде типов клеток он описан в масштабе часов, а не суток, — и биосинтетические пути ниже представляют собой не формальность, а постоянную необходимость.

Откуда берётся NAD+: три пути к одной молекуле

NAD+ образуется тремя сходящимися биосинтетическими путями, каждый из которых заканчивается сборкой динуклеотида из мононуклеотидного промежуточного соединения. Только один из них строит пиридиновое кольцо с нуля; два других начинают с кольца, которое было съедено, всосано или возвращено в оборот. Точка схождения — семейство ферментов NMNAT (никотинамидмононуклеотид-аденилилтрансфераза), которое с помощью ATP пристраивает AMP-половину к никотинамидной и существует в виде трёх изоформ с разной «пропиской»: NMNAT1 в ядре, NMNAT2 в цитозоле, NMNAT3 в митохондриях. Эта компартментализация важна, потому что NAD+ — крупная заряженная молекула, свободно через мембраны не проходящая, так что каждый компартмент содержит собственный пул.

• Синтез de novo из триптофана по кинурениновому пути. Триптофан раскрывается ферментами IDO или TDO до N-формилкинуренина и проходит через кинуренин и 3-гидроксиантранилат до хинолиновой кислоты, которую хинолинат-фосфорибозилтрансфераза превращает в мононуклеотид никотиновой кислоты. Это единственный путь, создающий само кольцо; он работает главным образом в печени и почках и неэффективен — классическое учебное соотношение составляет около 60 мг триптофана на 1 мг ниацина.
• Путь Прейсса — Хандлера, из никотиновой кислоты. Никотинат-фосфорибозилтрансфераза соединяет никотиновую кислоту с PRPP, давая мононуклеотид никотиновой кислоты; NMNAT аденилилирует его до адениндинуклеотида никотиновой кислоты, а глутамин-зависимая NAD-синтетаза амидирует его до NAD+.
• Путь спасения, из никотинамида. Никотинамид-фосфорибозилтрансфераза (NAMPT) соединяет никотинамид с PRPP, образуя никотинамидмононуклеотид, а NMNAT достраивает молекулу. NAMPT — лимитирующая стадия, и её ингибирование в клеточной культуре обрушивает уровень NAD+ за считаные часы.
• Точки входа рибозида и мононуклеотида. Никотинамидрибозид фосфорилируется киназами никотинамидрибозида NRK1 и NRK2 до никотинамидмононуклеотида и включается в путь спасения на шаг ниже NAMPT. Внеклеточный NMN, по имеющимся данным, обычно дефосфорилируется эктоферментом CD73 до рибозида перед поглощением клеткой; работает ли при этом и прямой транспортёр NMN, в литературе остаётся открытым вопросом.

В большинстве клеток млекопитающих преобладает путь спасения, и причина здесь структурная, а не случайная. Каждая реакция сиртуина, PARP или CD38 высвобождает одну молекулу никотинамида, так что клетка непрерывно производит ровно тот субстрат, который требуется NAMPT. Путь спасения замыкает этот контур: никотинамид из ферментов-потребителей возвращается в NMN, а затем в NAD+. Синтез de novo из триптофана вне печени даёт сравнительно небольшую долю, а путь Прейсса — Хандлера зависит от поступления никотиновой кислоты с пищей или от микробиоты кишечника. Клетка, лишённая возможности спасения, не может достаточно быстро компенсировать это двумя другими путями, — именно поэтому ингибирование NAMPT служит столь широко используемым экспериментальным приёмом для истощения NAD+ in vitro.

Что данные не устанавливают

Всё изложенное выше — устоявшаяся биохимия, подтверждённая десятилетиями энзимологических и структурных работ, и стоит прямо сказать: маркетинговые заявления о продуктах с NAD+ из неё не следуют. То, что молекула необходима для метаболизма, ничего не говорит о том, что произойдёт при попытке повысить её уровень. Литература не устанавливает:

• Эффектов против старения, прироста энергии или увеличения продолжительности жизни у людей. Сообщения о снижении тканевого NAD+ с возрастом получены преимущественно на животных моделях и технически трудны для количественной оценки, поскольку NAD+ нестабилен и разрушается при экстракции; это не доказательство пользы от его повышения у человека.
• Что повышение измеряемого уровня метаболитов NAD+ даёт какой-либо функциональный результат. В испытаниях молекул-предшественников конечными точками, как правило, служили биохимические, а не клинические показатели.
• Что NAD+, поданный извне клетки, достигает внутриклеточного пула в неизменном виде. NAD+ крупен и заряжен, свободно через плазматическую мембрану не проходит, а внеклеточный NAD+ в основном расщепляется эктоферментами ещё до какого-либо поглощения.
• Дозировок, путей введения или безопасности у человека — описанная здесь биохимия этих вопросов не касается.
• Что находки по сиртуинам и биологии старения на дрожжах, червях, мухах и мышах переносятся на людей. Это остаётся неизвестным.

Ссылки ниже указывают на первичную литературу по биосинтезу NAD, редокс-энзимологии и семействам ферментов, расходующих NAD+, а на странице товара перечислена аналитическая документация, доступная для исследовательского материала.