Recorra cualquier catálogo de péptidos y la palabra acetato aparecerá una y otra vez: oxitocina acetato, LL-37 (human) acetate, y así sucesivamente. Cumple dos funciones completamente distintas, y quien no las separe leerá mal tanto el certificado de análisis como la masa impresa en el vial.
En un sentido es una sal: iones acetato emparejados con los grupos básicos del péptido, dejados atrás por la última etapa de purificación. En el otro es un grupo acetilo unido al extremo N del péptido, que forma parte de la molécula y no puede lavarse. La timosina alfa-1 es el compuesto donde ambos sentidos coinciden en el mismo vial.
- Un contraión acetato pesa 59,04 g/mol y no forma parte de la estructura del péptido.
- Un grupo acetilo N-terminal es covalente, añade unos 42,04 g/mol y se escribe como Ac- al inicio de la secuencia.
- La espectrometría de masas registra el grupo acetilo y nunca ve el contraión, que se disocia antes de la detección.
- La pureza por HPLC es un porcentaje de área del cromatograma; no dice qué parte del peso del polvo es péptido.
- La cifra que responde a eso es el contenido peptídico, y es una determinación aparte.
Dos cosas distintas, una sola palabra
Un péptido sintético se separa de su resina y se purifica por HPLC de fase reversa, normalmente en una fase móvil que contiene un ácido. A ese pH las cadenas laterales básicas — lisina, arginina, histidina — y cualquier amina N-terminal libre están protonadas, y cada sitio protonado retiene un contraión. Al secar las fracciones recogidas, esos contraiones permanecen en el polvo. Del liofilizador sale una sal del péptido, y el anión es el del ácido que hubiera en la fase móvil.
Un grupo acetilo no es nada de eso. Es carbono, hidrógeno y oxígeno unidos al nitrógeno N-terminal en lugar de un hidrógeno: una adición neta de unos 42,04 g/mol, escrita en la propia secuencia. La secuencia de la timosina alfa-1 empieza por Ac-Ser-Asp-Ala-Ala. Ese Ac- es el grupo acetilo, y una preparación sin él es otro compuesto: 42 g/mol más ligero, con una amina libre donde debería estar el acetilo.
Por qué la espectrometría de masas responde a una pregunta y no a la otra
La espectrometría de masas es la comprobación de identidad habitual en un certificado de péptido: mide la masa de los iones que el instrumento genera a partir de la muestra. Un grupo acetilo covalente viaja con el péptido a la fase gaseosa, así que un péptido acetilado pesa unas 42 unidades más que la misma secuencia sin él. En la timosina alfa-1 son 3108,3 g/mol frente a unos 3066 de la forma desacetilada: una diferencia que cualquier equipo de rutina resuelve con holgura.
