Слово «ацетат» встречается в каталогах пептидов постоянно: окситоцин ацетат, LL-37 (human) acetate и так далее. При этом оно выполняет две совершенно разные роли, и читатель, который их не разделяет, неверно прочтёт и сертификат анализа, и цифру массы на флаконе.
В одном смысле это соль: ионы ацетата, связанные с основными группами пептида и оставшиеся после последней стадии очистки. В другом — ацетильная группа, присоединённая к N-концу; она является частью молекулы, и смыть её нельзя. Тимозин альфа-1 — соединение, где оба смысла сходятся в одном флаконе.
- Противоион ацетата весит 59,04 г/моль и не входит в структуру пептида.
- N-концевая ацетильная группа ковалентна, добавляет около 42,04 г/моль и записывается как Ac- в начале последовательности.
- Масс-спектрометрия показывает ацетильную группу и не видит противоион: он диссоциирует до детекции.
- Чистота по ВЭЖХ — это доля площади на хроматограмме, а не доля массы порошка, приходящаяся на пептид.
- На этот вопрос отвечает содержание пептида, и это отдельное определение.
Два разных явления под одним словом
Синтетический пептид снимают со смолы и очищают обращённо-фазовой ВЭЖХ, обычно в подвижной фазе с кислотой. При таком pH основные боковые цепи — лизин, аргинин, гистидин — и свободный N-концевой амин протонированы, и каждый протонированный центр удерживает противоион. После сушки собранных фракций эти противоионы остаются в порошке. Из лиофилизатора выходит соль пептида, а анион — тот, чья кислота была в подвижной фазе.
Ацетильная группа — совсем другое. Это углерод, водород и кислород, связанные с азотом N-конца вместо одного водорода: чистая прибавка около 42,04 г/моль, вписанная в саму последовательность. Последовательность тимозина альфа-1 начинается с Ac-Ser-Asp-Ala-Ala. Это Ac- и есть ацетильная группа, а препарат без неё — другое соединение: на 42 г/моль легче, со свободным амином на месте ацетила.
Почему масс-спектрометрия отвечает на один вопрос и не отвечает на второй
Масс-спектрометрия — стандартная проверка идентичности в сертификате на пептид: прибор измеряет массу ионов, полученных из образца. Ковалентная ацетильная группа уходит в газовую фазу вместе с пептидом, поэтому ацетилированный пептид оказывается примерно на 42 единицы тяжелее той же последовательности без неё. Для тимозина альфа-1 это 3108,3 г/моль против примерно 3066 у дезацетильной формы — разрыв, который уверенно разрешает любой рабочий прибор.
Противоион в эту дорогу не отправляется. Ионная пара расходится в источнике, и ацетат не появляется в измеренной массе пептида. Масс-спектр, таким образом, устанавливает, ацетилирована ли молекула, и не говорит ровным счётом ничего о том, какая это соль. Показатель чистоты столь же слеп: чистота по ВЭЖХ — доля площади пика пептида от всей площади хроматограммы, а противоион, не поглощающий на длине волны детекции, площади не даёт вовсе.
